ELISA检测

ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断等领域的检测技术，以下是关于 ELISA 检测的详细介绍：

一、原理

ELISA 的基本原理是抗原 - 抗体的特异性结合反应。主要利用酶标记的抗体（或抗原）来检测样品中相应的抗原（或抗体），通过酶与底物反应产生的颜色变化来进行定量或定性分析。

1. 抗原 - 抗体反应：

• 抗原和抗体之间的结合是高度特异性的，就像一把钥匙配一把锁。例如，在检测病毒感染时，病毒表面的特定抗原可以与对应的抗体特异性结合。这种结合反应在 ELISA 的塑料微孔板表面进行，微孔板的孔壁可以吸附抗原或抗体。

2. 酶标记：

• 通常将抗体或抗原与一种酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）进行化学连接。这种酶在特定的底物存在下能够催化化学反应，产生有色产物。例如，辣根过氧化物酶在过氧化氢存在下，可以将底物（如四甲基联苯胺）氧化，产生蓝色产物。

3. 显色反应：

• 当酶标记的抗体（或抗原）与目标抗原（或抗体）结合后，加入相应的底物溶液，酶就会催化底物反应。产生的颜色深浅与样品中目标抗原（或抗体）的含量呈正相关。通过分光光度计等设备检测吸光度，就可以对样品进行定量分析；也可以根据颜色的有无进行定性判断。

二、类型

1. 间接 ELISA：

• 主要用于检测样品中的抗体。首先将已知抗原包被在微孔板表面，加入待检测的样品（含有抗体），孵育后，样品中的抗体与包被抗原结合。然后加入酶标记的二抗（针对一抗的抗体），再次孵育，二抗就会与一抗结合。最后加入底物显色，通过检测吸光度来定量样品中的抗体含量。

• 例如，在检测人体血清中的某种病毒抗体时，先将病毒抗原包被在微孔板上，让血清中的抗体与之结合，后续操作完成显色反应进行检测。

2. 直接 ELISA：

• 用于检测抗原。将酶标记的抗体直接与待检测的抗原样品一起孵育，然后加入底物显色。这种方法相对简单，但灵敏度可能不如间接 ELISA。

• 比如，在检测食品中的特定蛋白质过敏原时，可以用酶标记的抗该过敏原的抗体直接与食品提取物（可能含有过敏原）一起孵育，然后进行显色反应检测。

3. 夹心 ELISA：

• 这是一种高灵敏度的检测抗原的方法。首先将捕获抗体（一种对目标抗原特异性的抗体）包被在微孔板表面，加入待检测的抗原样品，抗原会与捕获抗体结合。然后加入另一种酶标记的检测抗体（也是针对目标抗原的抗体），形成 “夹心” 结构，最后加入底物显色。

• 常用于检测生物样本中的低浓度蛋白质抗原，如在检测血液中的细胞因子时，通过两种针对细胞因子不同表位的抗体来实现高灵敏度的检测。

三、技术流程

1. 包被：

• 根据检测类型，选择合适的抗原或抗体，用缓冲液稀释后加入微孔板的孔中，一般在 4℃过夜或在 37℃孵育一定时间，使抗原或抗体吸附在孔壁上。

• 例如，在检测某种细菌毒素抗原时，将抗毒素抗体用包被缓冲液稀释后加入微孔板，进行孵育。

2. 封闭：

• 用无关的蛋白质（如牛血清白蛋白）溶液加入微孔板的孔中，在 37℃孵育一段时间，目的是封闭微孔板上未被抗原或抗体占据的位点，减少非特异性吸附。

• 这一步很重要，因为非特异性吸附会导致背景信号过高，影响检测的准确性。

3. 加样：

• 将待检测的样品（如血清、组织提取物等）加入微孔板的孔中，在合适的温度下孵育一定时间，使样品中的抗原或抗体与包被的抗原或抗体结合。

• 孵育时间和温度根据具体的实验要求和抗原 - 抗体反应特性来确定。

4. 洗涤：

• 用洗涤缓冲液（如含有吐温 - 20 的磷酸盐缓冲液）反复洗涤微孔板的孔，去除未结合的物质，减少非特异性结合。

• 一般洗涤 3 - 5 次，每次浸泡一定时间后倒掉洗涤液，最后在吸水纸上拍干微孔板。

5. 加酶标抗体或抗原：

• 根据检测类型，加入酶标记的抗体或抗原，在合适的温度下孵育一定时间，使酶标试剂与结合在微孔板上的抗原或抗体结合。

• 例如，在间接 ELISA 中，此时加入酶标记的二抗。

6. 洗涤：

• 同步骤 4，再次洗涤微孔板，去除未结合的酶标试剂。

7. 显色：

• 加入合适的底物溶液，在一定的温度和时间下孵育，使酶催化底物反应产生颜色变化。

• 不同的酶和底物组合会产生不同的颜色，如辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺产生蓝色。

8. 终止反应：

• 当显色达到合适程度后，加入终止液（如硫酸）来终止反应。此时颜色会发生变化，例如蓝色可能变为黄色。

9. 检测：

• 使用酶标仪在特定波长下检测每个孔的吸光度，根据标准曲线（由已知浓度的标准品建立）来计算样品中抗原或抗体的含量，或者根据设定的临界值进行定性判断。

四、应用领域

1. 医学诊断：

• 检测病原体及其抗体，如检测乙肝病毒抗原和抗体，用于诊断乙肝感染状态。

• 检测肿瘤标志物，辅助癌症的早期诊断和病情监测。例如，检测血清中的癌胚抗原用于结肠癌的诊断和监测。

• 检测自身免疫性疾病的相关抗体，如检测抗核抗体用于系统性红斑狼疮的诊断。

2. 食品安全检测：

• 检测食品中的过敏原，如牛奶、鸡蛋、花生等过敏原的检测，保障过敏人群的食品安全。

• 检测食品中的毒素，如黄曲霉毒素、肉毒毒素等，确保食品质量。

3. 生物医学研究：

• 研究细胞因子、激素等生物活性分子在生理和病理过程中的表达变化。例如，在炎症研究中，检测血清或组织中的炎性细胞因子水平。

• 用于检测蛋白质 - 蛋白质相互作用研究中的抗原 - 抗体结合情况。

**五、优势与局限性** 1. 优势   - 高灵敏度：ELISA能够检测到极低浓度的抗原或抗体。例如，在一些疾病的早期诊断中，它可以检测出血液中微量的病原体抗体或者生物标志物，这对于疾病的早期发现和干预非常关键。   - 特异性强：基于抗原 - 抗体的高度特异性结合，ELISA可以准确地识别目标抗原或抗体，减少假阳性结果。如在复杂的生物样本（如血清）中，能够精准地检测出特定的蛋白质抗原，而不受其他相似蛋白质的干扰。   - 高通量：可以同时检测多个样本。微孔板的规格有96孔、384孔等，能在一次实验中对大量样本进行检测，这在大规模的疾病筛查、生物样本库研究等场景中非常实用。   - 操作相对简单：不需要复杂的仪器设备（除酶标仪外）和专业的技术培训，一般实验室人员经过简单培训即可掌握操作流程。而且整个实验过程可以在普通实验室环境下完成。   - 适用范围广：几乎可以检测任何具有抗原性或抗体活性的物质，包括蛋白质、多肽、激素、病毒、细菌等，无论是在医学、生物学还是食品、环境等领域都有广泛的应用。 2. 局限性   - 半定量或定量的准确性有限：虽然可以通过标准曲线进行定量，但ELISA的结果可能会受到多种因素的影响，如抗原或抗体的纯度、反应条件、酶活性等，导致定量结果存在一定的误差。在一些对定量精度要求极高的研究中，可能需要结合其他更精准的定量方法。   - 可能出现交叉反应：尽管抗原 - 抗体反应具有特异性，但在某些情况下，抗体可能会与结构相似的抗原发生交叉反应，产生假阳性结果。例如，一些自身免疫性疾病的抗体检测中，可能会因为其他自身抗原的干扰而出现误诊。   - 检测时间较长：整个检测流程包括孵育、洗涤、显色等多个步骤，通常需要数小时甚至更长时间才能完成，对于一些需要快速检测的场景（如急诊诊断）不太适用。   - 对试剂要求高：需要高质量的抗原、抗体和酶标记试剂，这些试剂的质量和稳定性会直接影响检测结果。而且，一些特异性高的试剂可能价格昂贵，增加了检测成本。 **六、质量控制与标准化** 1. 试剂质量控制   - 抗原和抗体：确保其纯度、活性和特异性。在购买或制备抗原和抗体时，需要进行严格的质量检验，如通过免疫印迹（Western Blot）等方法验证抗体的特异性，通过蛋白含量测定等方法检查抗原的纯度。   - 酶标记试剂：检查酶的活性和标记效率。酶的活性可以通过特定的酶活性测定方法来评估，标记效率可以通过放射性标记或其他定量标记方法来确定。   - 底物：保证底物的质量和稳定性。底物应该在有效期内使用，并且储存条件要符合要求，以确保其能够正常反应产生准确的显色信号。 2. 实验操作标准化   - 包被条件：严格控制抗原或抗体的包被浓度、时间和温度。不同的抗原或抗体可能有不同的最佳包被条件，需要通过实验来确定，以保证抗原或抗体能够有效地吸附在微孔板表面。   - 孵育条件：包括样品、酶标试剂等的孵育时间和温度。孵育时间过短可能导致反应不完全，过长则可能增加非特异性吸附，所以要按照标准的操作流程进行。   - 洗涤步骤：确保洗涤充分且一致。洗涤不充分会导致背景信号过高，而过度洗涤可能会洗掉部分结合的抗原或抗体，影响检测结果。可以使用自动化的洗板机来保证洗涤的一致性。 3. 标准曲线的建立与验证   - 标准品的选择：使用已知浓度的标准品来建立标准曲线，标准品的准确性和稳定性至关重要。标准品应该与待测物质具有相同的性质和活性，并且浓度范围要覆盖待测样品的可能浓度区间。   - 标准曲线的绘制：通过对不同浓度标准品的检测，得到吸光度值，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。曲线应该具有良好的线性关系，并且要定期验证和更新，以确保定量结果的准确性。